作者l胡杨
编辑l细胞房间
单纯疱疹病毒（HSV）
美国制药巨头Amgen公司的溶瘤病毒药物Talimogenelaherparepvec（简称T-Vec，品牌名Imlygic）是一种经过基因修饰的I型单纯疱疹病毒（HSV-1），也是FDA批准的第一个溶瘤病毒药物，它可以选择性地在肿瘤细胞内复制并表达免疫激活蛋白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），加速抗肿瘤的免疫应答及促进肿瘤的裂解，主要用于晚期黑色素瘤的肿瘤的治疗。
图1.溶瘤病毒作用机制
单纯疱疹病毒是属于疱疹病毒科α病毒亚科的双链DNA病毒，有两种亚型，即HSV-1和HSV-2。二者基因组相似，序列有50%的同源性，通过DNA限制性内切酶分析来区分。晚期蛋白中有11种包膜糖蛋白（gB~gM）。其中gB和gD与病毒吸附和穿入有关，是与细胞特异性受体相互作用的病毒配体分子；gD诱导产生中和抗体的能力最强，可用于研制疫苗；gC是补体C3b-结合蛋白；gE是Fc受体，可与IgG的Fc端结合；gG为分型特异性抗原，以此抗原能区别HSV-1（gG-1）和HSV-2（gG-2）；gH与病毒的释放有关。
图2.单纯疱疹病毒的结构
HSV-1的基因组约kb（34个基因，编码70多个多肽），病毒颗粒大小-nm，在病毒的包膜和衣壳之间含有一个称为被膜的区域，含超过20种HSV蛋白，包括12种糖蛋白，另外，衣壳由7种不同的蛋白质组成。
I型单纯疱疹病毒的改造
T-Vec是敲除了野生HSV-1的ICP34.5、ICP47基因，并插入表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）细胞因子的基因。ICP34.5基因的功能缺失，可抑制病毒在正常组织中的复制。ICP47的缺失导致US11启动子早期激活，从而增强病毒复制，促进抗原表达，从而导致更好的抗肿瘤免疫反应，增强杀伤。将hGM-SF表达盒插入ICP34.5位点，表达具有生物活性的hGM-CSF，刺激肿瘤细胞的免疫反应，增强溶瘤效果。每个hGM-CSF表达盒由巨细胞病毒（CMV）早期启动子、编码hGM-CSF的DNA片段及牛生长激素多聚腺苷酸化信号（pA）组成。T-Vec基因组的示意图如下：
图3.T-Vec基因组结构
另外，众多种类的溶瘤产品插入表达了许多细胞因子，包括IL-12、干扰素INF等。
由于敲除了ICP34.5和ICP47基因并表达了hGM-CSF基因，所以在T-Vec质控的工作中需对基因组酶切、琼脂糖凝胶电泳分析，并对基因组进行测序鉴定，验证hGM-CSF基因的插入位点及ICP34.5和ICP47基因的敲除（亦可通过Southern及PCR进行验证）。对商业化的HSV-1病毒改造而成的溶瘤病毒需制备多克隆抗体进行免疫鉴定，特别是HSV-1病毒的糖蛋白。表达的hGM-CSF细胞因子需要进行详细的结构确认、表达量检测及生物活性分析等。
T-Vec的发酵、纯化和质控
在发酵、生产T-Vec过程中，病毒可以通过同源重组产生分子变体，因此也应该考虑对可能存在的分子变体进行评估。一些分子变异体可在肿瘤组织中特异性增殖，导致出现不良副作用，这也是溶瘤病毒治疗的风险之一，故在溶瘤病毒的质量控制中通常需检测野生型（或复制型）病毒。如：用于重组腺病毒制备的生产细胞多为HEK细胞，它是一种经基因工程改造过的人胚肾细胞，细胞基因组中含腺病毒E1基因。E1缺失的重组腺病毒不能在一般的细胞中进行复制并包装成病毒颗粒，但可以在含E1基因的HEK细胞中扩增出高滴度的病毒颗粒。由于从理论上存在重组腺病毒与生产细胞进行重组或其他途径产生具有复制性腺病毒（RCA）的可能，而RCA可感染许多类型的细胞并通过无限制的病毒复制导致靶细胞死亡，从而产生副作用。因此，FDA和NMPA对重组腺病毒临床级制品的RCA水平都作了明确的规定，每个剂量（1×10^12vp）不应超过1个RCA。
另外，ICH考虑建议在人类临床研究中使用溶瘤病毒之前应该证明其对肿瘤细胞的选择性，并且应进行溶瘤病毒在肿瘤细胞系中的细胞毒性、裂解和复制的体外测定（质控工作的一部分）。目前，许多体外培养的连续细胞系（CCL）已被用于评估溶瘤病毒的肿瘤特异性。
为提高病毒产量和纯度，可采用微载体培养或在生物反应器中产生更高滴度的病毒。此外，开发与病毒纯化兼容的色谱纯化方法（如离子交换，分子筛）有助于去除非颗粒相关的核酸和蛋白质，从而提高产品的质量。
从纯化的角度来看，生产减毒活病毒通常采用标准程序，包括从受感染的生产细胞中取上清液，经分子排阻层析、离子交换层析并通过Benzonase去除污染DNA，再经无菌过滤和分装等得到终产品。纯化过程中为了避免离心（离心剪切力容易导致病毒裂解），可采用切向流动过滤进行浓缩。以下纯化步骤，几乎对所有溶瘤病毒都是通用的：①澄清过滤以清除细胞碎片；②核酸酶降解宿主细胞核酸；③离子交换/大小排除层析纯化病毒；④用于浓缩和缓冲液交换的超速离心或切向流动超滤/透滤；⑤终端无菌过滤。
在鉴定方面，通过酶切分析或DNA测序证实质粒结构的正确性；可以使用Westernblotting来鉴定、检测病毒关键蛋白及其表达量，并使用产品特异性PCR或Southernblot来确定基因组结构。宿主DNA残留量应控制在≤5pg/10^11vp；而对于病毒颗粒数/滴度（比活，vp/ip），FDA建议vp/ip比率为不低于30。
病毒的比活是通过评估感染颗粒与病毒蛋白的比例来控制的，由于已经建立了病毒总蛋白与病毒总粒子之间的相关性，认为病毒总蛋白是病毒总颗粒的合适替代，因此通过评估病毒感染颗粒与病毒蛋白的比值，作为放行控制。
另外，T-Vec需从三个方面来评估病毒的关键生物学功能：病毒生物滴度、hGM-CSF细胞因子的表达量及hGM-CSF的生物学活性。
T-Vec的制剂
T-Vec是在磷酸钠缓冲液中配制，氯化钠作为强化剂，山梨醇和肌醇作为稳定剂，配方中所有辅料均符合美国药典（USP）、英国药典（BP）、日本药典（JP）或欧洲药典（PhEur）规定，见3.2.P.4
T-Vec是一种无菌、无防腐剂的局部注射用药物，有1ml两种不同浓度的单次注射小瓶：①10^6PFU/mL仅用于初始剂量；②10^8PFU/mL用于所有后续治疗剂量。每次治疗的总注射量应不超过4毫升。初始推荐剂量最高为4mL浓度为10^6PFU/mL，后续剂量浓度为10^8PFU/mL的情况下最多给予4mL。T-Vec需储存于-80℃，使用时在室温下解冻，一旦解冻不可复冻，可保存12小时（10^6PFU/ml）至48h（10^8PFU/ml），如有泄露，应使用10%的漂白剂溶液配合吸附剂清洁表面。
根据肿瘤大小确定最大注射量，T-Vec的注射量因肿瘤大小而异：直径≤0.5cm的肿瘤注射量为0.1ml，直径0.5-1.5cm的肿瘤注射量为0.5ml，直径1.5-2.5cm注射量为1ml，直径2.5-5cm注射量为2ml，＞5cm的肿瘤注射量为4ml（单次最大注射量），当存在多个病灶时，建议先以最大的病灶为主。
小结
溶瘤病毒种类多、调控手段多样、可以作为载体表达不同功能的外源基因来增强肿瘤杀伤，这些是溶瘤病毒治疗肿瘤的优势。大量的临床研究结果已经显示了溶瘤病毒疗法尤其溶瘤病毒联用疗法在肿瘤治疗领域良好的应用前景。但溶瘤病毒疗法仍然存在着很多须要解决的难题，在产品开发过程中，溶瘤病毒产品的质量、安全性和有效性还存在着许多问题：①溶瘤病毒设计的难度较大（野生型、减毒和工程菌株）；②溶瘤病毒产品开发中需要概念验证（proof-of-concept，POC）；③溶瘤病毒复制和靶向癌细胞的选择性验证；④非临床研究中相关动物模型的发展；⑤临床安全确保，是否存在非特异性感染；⑥病毒脱落（virusshedding）的评估；病毒脱落（virusshedding）：指病毒在宿主细胞感染期间成功繁殖后病毒后代的排出和释放。⑦机体对病毒产生抗性，导致溶瘤效果降低。
抗溶瘤病毒抗体可能作为先天免疫的一部分存在于人类血清中，或由于多次使用该疗法而产生，可限制其系统性使用。此外，溶瘤病毒在肿瘤中不易渗出，并被肝脏隔离。对于POC研究和病毒脱落的评估，分析动物模型中溶瘤病毒在靶组织和非靶组织中的分布可能是有用的。例如，定量聚合酶链式反应（Q-PCR）等敏感方法可用于分析溶瘤病毒的生物分布。
虽然溶瘤病毒在动物模型和临床试验中均获得了显著的效果，但其临床安全性的研究尚需进一步探讨。随着对溶瘤病毒研究的不断深入，如何将溶瘤病毒制剂有效安全地向临床转化必然会成为肿瘤临床治疗的重要研究方向。
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