柯萨奇病毒的临床检测进展
在引起病毒性心肌炎（viralmyocarditis，VMC）的病原中，柯萨奇病毒（coxsackievirus，COX）较常见。柯萨奇病毒的临床检测主要有病毒分离、血清学检查和分子生物学技术。柯萨奇病毒性心肌炎的临床表现缺乏特异性，病毒分离及传统的血清学检查已不适应快速诊断的需要，近年来包括各种聚合酶链反应及限制性内切酶检测法发展迅速，在柯萨奇病毒的临床检测中发挥重要作用。
柯萨奇病毒是一种肠道病毒（enterovirus，EV），属于RNA病毒科，分为A（23个）和B（6个）两类血清型。柯萨奇病毒是最常见的导致儿童或＜35岁的年轻人心肌炎的病原之一。柯萨奇病毒感染常见于年龄较大的儿童和成年人，但很少造成严重的疾病，然而，新生儿围产期获得感染却常常是致命性的，尤其是伴有暴发性心肌炎、肝炎和脑膜脑炎时，病死率可高达42％。VMC的临床表现缺少特异性，病原体的检测困难，为了提高临床诊疗水平，需要不断改进检测方法。
一、病毒分离
检测肠道病毒的传统方法是基于细胞培养进行的病毒分离。病毒分离可提供病原学证据，长期以来被认为是病毒病原学诊断的金标准。既往报道显示上呼吸道（鼻咽分泌物）、胃肠道（粪便标本）以及脑脊液标本中具有较高的病毒分离率，而血和尿中相对少见。由于病毒复制和排毒时间要求严格，没有分离出病毒并不能证实病毒不存在，而且病毒培养需要几天至几周才能得出结论，检测方法缺乏敏感性和特异性。因此，柯萨奇肠道病毒的分离对临床工作的指导意义不大。
二、血清学检查
1．传统的血清学检查
传统的血清学检查常用的有特异性IgM和中和抗体。使用酶联免疫试验法来检测柯萨奇病毒的特异性IgM或IgG，特异性高，操作简便、费用低、省时，常用于回顾性诊断，也可用于暴发流行时的调查研究。但其敏感性较低，加上肠道病毒血清型多，给临床检测带来不便。随着发现的病毒型别增加，要做许多交叉中和试验，加上不同的血清型别之间具有部分抗原交叉性，用中和试验来鉴定病毒型别比较费时、费力。
2．单克隆抗体技术
肠道病毒衣壳蛋白VPI为四个结构蛋白之一，其抗原同源性在不同的肠道病毒血清型已有描述。目前单克隆抗体技术发展日臻完善，Lynn等克隆出柯萨奇病毒B3（COXB3）的全长VPI基因序列，并且以其编码的蛋白作为抗原，来扩大肠道病毒单克隆抗体的检测范围。通过四种肠道病毒血清型（Poliol，CoxB3，EV70，EV71）制成全长重组VPI蛋白，用作免疫原来进行杂交。选出最优的单克隆抗体结合起来制成广谱一肠道病毒单克隆抗体复合物。研究证实，广谱-肠道病毒单克隆抗体复合物可以检测出所有的40个拟检测肠道病毒，并且对18个非肠道病毒无交叉反应，特异性更高、检测范围更广。因此，全长CVB3的VPl基因有望作为发展广谱-肠道病毒单克隆抗体有效的抗原来源，用于肠道病毒的实验室诊断。
三、分子生物学
1．聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）
PCR技术以感染组织中病毒的核酸相关序列为目标，来获得组织细胞感染病毒最直接的证据。PCR技术可以特异性地扩增病毒的核酸片段，阳性即说明患者处于病毒感染期。它能真实反映患者体内的病毒感染状况，具有其他检验技术所不具备的优势。对于肠道病毒来说，PCR检测有％特异性，94％至97％的敏感度。目前在美国疾病预防控制中心，分子生物学定型方法已经取代了常规中和试验来进行肠道病毒的鉴定。
2．逆转录聚合酶链反应（reversetranscriptionalPCR，RT-PCR）
通过RT-PCR和不完全基因测序，人们已经可以测出肠道病毒的完整的基因序列。与病毒分离相比，RT-PCR有敏感、快速、特异性强等特点。由于RT-PCR技术只对与引物序列互补的模板进行特异的扩增，并且可以扩增一个分子的模板，灵敏性和特异性大大优于免疫学方法。但是，该项技术对灵敏度要求非常高，若操作不当发生污染，易将极微量的非目的基因的小片段扩增到微克水平，产生假阳性结果，这是该类技术的一个主要缺点。
3．逆转录PCR-核酸探针杂交法
根据获得的CVBl～6型的基因序列，发现CVB各型在结构基因区变异很大，很难找到合适的引物位点，但在5’端的非编码区其序列比较保守，故在该区运用计算机OLIGO、DNASIS软件自行设计了一对通用引物，上游引物为5’-CGGTAC-CTTTGTGGGCCTGTI-3’（63～83位），下游引物为5’-GCGGTG（A／G）CTCATCGACCTGA-3’（～位），以及CVB六个型别的特异性寡核苷酸探针，分别共价结合，称逆转录PCR-核酸探针杂交法，可准确对CVB各型进行分类。与ELISA法的分型比较，该法无错误分型，具有很好的一致性。CVB的RNA出现早于IgM抗体的出现，可用于早期诊断。
4．实时PCR
最近，肠道病毒实时PCR检测，具有更短的周期，已渐发展起来并证实有较高的灵敏度和特异性。该方法是一种新的荧光定量为基础的实时PCR，它可针对不同临床标本的所有肠道病毒。而且，可直接用于病毒定量。通过与传统的病毒培养及巢式PCR比较，这种方法可以在4～5小时内出结果，很容易标准化，
不需要任何PCR后技术处理，因此可以用来作常规诊断肠道病毒。对于大多数实时PCR，荧光的获取是基于探针的杂交，但是，核苷酸的错配很可能会丢失阳性的标本。在未知的单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymer-phism，SNP）的影响下，特异性的实时检测并不总是很明显，但据实时探针下游的SNP数目和位置可以用来判断该法是否有假阴性结果或不正确的量化。实时PCR另一个潜在的缺点是其固有的荧光背景能够产生弱荧光信号，这个背景来自所用仪器，检测化学物质、染料和使用的骤冷剂，从而干扰实验结果的观察。此外，由于杂交过程中探针不水解，它们仍然可以用熔融曲线分析和扩增产物确认来获得。能够通过熔融曲线来确认结果尤其有价值，并且有助于识别由实时探针下由SNP导致的假阴性结果。可以通过在引物和杂交探针修饰核苷酸来减少SNPs对实时PCR的影响。
5．限制性内切酶分析法
根据柯萨奇B组6个型别病毒共同的cDNA片段设计引物，扩增柯萨奇Bl～B6型病毒第64～位核苷酸，后分别应用限制性内切酶ScaI、SphI、NcoI、HindⅢ和Pstl对其6个型别进行酶切，然后将被检测样品酶切后产物的电泳图谱和标准图谱进行对比，可快速准确地对柯萨奇B组6个型别的病毒进行检测和分型。与传统的柯萨奇B组病毒的检测方法相比，该方法克服了柯萨奇B组病毒RNA在提取中极易被酶消化的问题，也避免了临床上所采用的ELISA法、分子杂交RT．PCR技术易出现的非特异性缺点。限制性内切酶分析法优于ELISA法和RT-PCR法，是一种特异性强、重现性好的病毒检测方法。
综上所述，对于临床表现非特异性的柯萨奇病毒性心肌炎而言，预后和治疗在很大程度上取决于建立一个快速和标准化的诊断方法。单克隆抗体技术及各种分子生物学方法具有较好的优越性，但又都有各自的缺点。
资料来源：
沈莉荣综述，华子瑜审核．柯萨奇病毒的临床检测进展．国际病毒学杂志，，17（1）31-34
