本文原载于中华医学杂志年16期-页
人肠道病毒属于小RNA病毒科肠道病毒属成员，能引起多种病毒性传染病[1,2]。根据生物学和遗传学特性，可将肠道病毒分为4个组：肠道病毒A、B、C、D组。A组中大部分血清型和B组的部分血清型病毒与手足口病和疱疹性咽峡炎发病有关，其中以肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型最为常见。近年来已经有多个地区爆发了由CVA4病毒感染引起的手足口病疫情[3,4,5]，CVA4病毒不仅能引起手足口病、疱疹性咽峡炎，还可以引起成人的心肌炎和胰腺炎。目前国内外针对CVA4的研究较少，且多限于对病毒的分离和鉴定。为了解深圳地区CVA4样本基因特征，本研究对深圳市年和年2起疱疹性咽峡炎疫情的6份咽拭子标本进行了检测，并对其中的CVA4阳性样本的VP1基因特征进行了分析。
资料与方法
1．样本采集和病毒核酸提取：
咽拭子标本采自年和年深圳市罗湖区某幼儿园发生的疱疹性咽峡炎疫情患儿，共计6份，其中年2份，编号为SZ–SK、SZ–SK7;年4份，编号为SZ–SK、SZ–SK、SZ–SK、SZ–SK。取咽拭子标本加入5ml的Hanks液重悬后，涡旋振荡1min后，4℃×g离心5min，取μl上清液，使用瑞士Roche公司的HighPureviralRNAkit试剂盒提取病毒RNA，洗脱体积为50μl，–80℃保存。
2．实时荧光定量反转录(RT)–PCR检测：
使用深圳太太基因有限公司的实时荧光RT–PCR肠道病毒CA16型–EV71型–肠道病毒通用型核酸检测试剂盒对样本RNA进行检测。荧光RT–PCR反应条件：50℃20min，95℃3min；95℃5s，60℃40s40个循环。选取肠道病毒CoxA16型和EV71型均阴性，仅肠道病毒通用型阳性的样本，进一步使用深圳市易瑞生物科技有限公司的CVA4、CVA6、CVA10的荧光RT–PCR试剂盒进行检测。其中CVA4病毒的RT–PCR反应体系为：PCR反应液19.1μl，逆转录酶0.5μl，Taq酶0.4μl，模板5μl。RT–PCR反应条件：45℃20min，95℃10s；95℃5s，53℃60s，45个循环。阳性判断标准：Ct值≤30时，样本判定为阳性；Ct值≥35时，判定为阴性；当30Ct值35时，重复实验1次，如仍在此范围，则按阳性处理。荧光定量PCR检测结果提示为CVA4病毒阳性，CVA6和CVA10阴性。
3．RT–PCR扩增及序列测定：
参照CVA4/SZ/CHN/09(GenBank：HQ)全基因组序列设计CVA4病毒VP1基因引物。采用TaKaRa公司的RNA反转录试剂盒，取3μl反转录好的病毒cDNA为模板，以25μl反应体系进行PCR反应扩增病毒VP1基因片段。上下引物序列分别为：CVA4VP1–up：5GGTGATGCAATTGCCGATGCTAT3；CVA4VP1–down：5TGCGAGCGTTGCTCAGCGTTGTA3。使用1.5%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析。PCR引物合成和序列测定由大连宝生物工程有限公司完成，然后利用ClustalX、bioedit、DNAStar软件中的MegAlign等软件进行序列间的核苷酸和氨基酸同源性比较，并MEGA6.0软件构建进化树，对扩增的CVA4病毒的VP1区进行进化分析。
结果
1．肠道病毒型别鉴定和病毒VP1基因的扩增：
深圳市罗湖区年和年2起疱疹性咽峡炎疫情标本共计6份，经荧光定量PCR检测鉴定全部为CVA4病毒感染，进一步进行RT–PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电游泳检测，有1条大小为bp左右的电泳带，与预期大小相符。RT–PCR结果见图1。
图1CVA4病毒VP1基因RT–PCR扩增结果 M示标准带；1～6泳道示6个阳性样本的VP1基因RT–PCR扩增产物
2．不同年份CVA4VP1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析：
将扩增的6份CVA4阳性样本进行VP1区核苷酸序列测定和分析。结果显示年的2株CVA4病毒株(SZ–SK，SZ–SK)之间的核苷酸同源性为%，年的4株CVA4病毒株(SZ–SK，SZ–SK，SZ–SK，SZ–SK)之间同源性也为%，证实CVA4病毒可能是引起这2起疱疹性咽峡炎疫情的病原体。比较不同年份CVA4病毒株的同源性，发现年的2株CVA4病毒与年的4株CVA4病毒株之间的核苷酸同源性为94.1%。而氨基酸同源性为98.7%，共有5个氨基酸突变，分别为aa22N–S、aa34T–A、aa63N–S、aaA–D、aaT–A(图2)。进一步比较年深圳CVA4病毒株与深圳9年参考株(HQ)的同源性，发现深圳9年分离株(HQ)与深圳年病毒株(SZ–SK，SZ–SK)核苷酸及氨基酸同源性分别为98%和99.6%，只有1个氨基酸突变位点aaV–A；而9年深圳分离株与深圳年CVA4株核苷酸和氨基酸同源性则分别为95%和98.3%。深圳年CVA4病毒株相对于深圳9病毒株氨基酸突变位点多达6个，突变位置为上述分析的6个位点(图2)。
图2深圳CVA4病毒VP1区氨基酸突变位点分析SK为深圳CVA4株；SK为深圳CVA4株；SZ/CHN/09为深圳CVA49分离株(HQ);GQ、GQ、GQ为我国山东省CVA4分离株；JQ、JQ为我国吉林省CVA4分离株；Highpoint为CVA4原型株
3．深圳不同地区CVA4VP1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分析：
将以上深圳地区年和年6份CVA4阳性样本的VP1核苷酸序列与原型株CVA4Highpoint(AY)及GenBank中已公布的国内外部分序列进行比较(表1)，这些CVA4参考序列均来自手足口病样本，发现深圳CVA4株在核苷酸序列上与山东CVA年病毒株(KF)核苷酸和氨基酸同源性最高，分别达96.4%和99.5%，而深圳CVA4株与吉林省6年的1株CVA4分离株(JQ)同核苷酸和氨基酸同源性最高，分别达94.7%和98.5%。值得注意的是，无论深圳CVA4株还是株均与吉林省的6年另外1株CVA4分离株JQ同源性最低，核苷酸和氨基酸同源性分别为87.9%～88.8%和96.6%～97.0%。
4．深圳地区CVA4VP1基因系统进化亲缘关系分析：
应用Mega6.0软件中Neighbor–Joining方法对深圳地区年和年的6株CVA4病毒株和18种GenBank的代表株基于VP1基因序列构建系统进化树进行分析。图3显示，深圳地区年和年的6株CVA4病毒均属于GⅠb亚型，其中深圳年CVA4株SZ–SK、SZ–SK与山东年分离株(KF)、云南地区年CVA4分离株(AB)、俄罗斯年分离株(KC)处于1个进化分支，进化关系最近。而年深圳病毒株(SZ–SK，SZ–SK，SZ–SK，SZ–SK)虽与深圳年CVA4株同属GⅠb亚型，但在GⅠb亚型内部形成1个独立的进化分支，与其他GⅠb亚型成员相隔较远。此外还发现吉林省6年分离的2株CVA4分离株分属于2个基因亚型。其中吉林省CVA46分离株(JQ)与中国台湾6年病毒株06–TW–同属一簇，进化关系最近属GⅠb亚型。而吉林省CVA46分离株(JQ)则和4年日本分离株(AB)和年的山东分离株(GQ)属于GⅠA亚型。
图3深圳CVA4VP1基因和CVA4基因型18个代表株VP1段系统进化分析
讨论
在4年和6年，中国台湾地区先后2次出现CVA4大爆发，而年CVA4病毒又实现了与CoxA16的共循环[5,6]。本研究结果显示，9至年深圳CVA4病毒株VP1区核酸序列较为稳定，并无核苷酸序列的插入和缺失。而年深圳CVA4病毒株相对于年则出现较多突变，共发现5个氨基酸有义突变位点aa22N–S、aa34T–A、aa63N–S、aaA–D、aaT–A，而相比9年深圳CVA4病毒株则在以上5个突变基础上又多了1个突变aaV–A。进一步分析深圳与其他地区的CVA4病毒差异，也发现同样的现象，即9和年的CVA4深圳毒株氨基酸序列与其他地区毒株相比变异不大，而年的深圳CVA4病毒株与之相比则有多个氨基酸突变位点，包括以上突变位点中的aa22N–S、aa63N–S和aaA–D。本研究发现年深圳CVA4病毒株与深圳年株和9年株相比，亚型分布并无变化，均属于GⅠb亚型。其中年深圳CVA4病毒株和深圳CVA49株、山东年分离株/LY/CHN/AM/10/CA4(KF)进化关系较近，而深圳CVA4株则有所不同，在GⅠb亚型内部形成1个独立的进化分支，显示其在GⅠb亚型内部进化走势上已经逐渐和深圳年株有所不同。这一现象背后的原因可能与年以后深圳地区手足口病病原谱分布变化有关。年之前深圳地区肠道病毒感染以EV71和CA16为主，CVA4病毒分布率低，感染人群少，病毒进化的选择压力也小，因此系统进化缓慢，而年之后深圳地区肠道病毒感染病原谱发生了改变，其他型肠道病毒分布比例大为提高，并爆发了多起由CVA4病毒感染引发的疱疹性咽峡炎疫情。感染人数大为增加，CVA4传播人群的增加使得肠道病毒间基因重组和突变的概率大大增加，随着时间的推移，其变异不断积累，发生大规模爆发和流行的概率将大为增加。因此，在肠道病毒的监测中，除对EV71和CVA16等常见病原的检测外，还应加强对CVA4等不常见病原的分型鉴定及分子流行病学分析，及时了解科萨奇病毒的病原分布及变异情况，进而为制定科学有效的防控措施提供依据。（参考文献：略）
本文编辑：张媛
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